No dia 5 de outubro de 1988, foi promulgada a nova Constituição brasileira, aprovada pela Assembleia Nacional Constituinte no dia 22 de setembro de 1988. Conhecida como Constituição Cidadã, ela traz referência expressa ao Ministério Público (MP) no Capítulo “Das funções essenciais à justiça”, definindo-o como instituição essencial à função jurisdicional do Estado e como responsável pela defesa da ordem jurídica, do regime democrático e dos interesses sociais e individuais indisponíveis. Retira-se também, do Ministério Público Federal, a atribuição de representação judicial da União.
Outra previsão expressa na Constituição foi a criação de cinco Tribunais Regionais Federais, que passariam a funcionar como segunda instância da Justiça Federal, substituindo o Tribunal Federal de Recursos, que funcionava em Brasília. Como a estrutura do MPF espelha a da Justiça Federal, o Ministério Público Federal passaria a contar com cinco Procuradoria Regionais da República, cujos membros atuam nos respectivos Tribunais.